有最大光吸收。由于绝大多数蛋白质中都含有酪氨酸或色氨酸，因此 280nm 的光吸收度是 蛋白质的一种普遍性质。在某些特定的程度下，蛋白质溶液在 280nm 吸光度与其浓度成正比，故 可作定量测定，核酸在紫外区（260nm）也有吸收，可通过校正加以消除。

  1． 利用机械破碎和高速离心分离等手段，从不一样的种类的鱼肌肉中提取水溶性蛋白和盐 溶性蛋白；

  3． 对以上蛋白提取液进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，并利用凝

  实验二 鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

  1． 了解从动物组织中提取蛋白的原理和实验方法； 2． 熟悉蛋白质含量测定的很多方法和基础原理，并根据实验结果，比较不一样的种类的鱼

  肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的差异； 3． 掌握 SDS-PAGE 的原理和垂直板型凝胶电泳的操作方法，并根据电泳结果，比较不

  鱼类肌肉蛋白按溶解性分为水溶性蛋白质（如各种蛋白水解酶）和盐溶性蛋白质（如 肌原纤维蛋白质）。

  为了了解鱼体肌肉组织中水溶性蛋白和盐溶性蛋白的含量，有必要进行蛋白含量的测定。 测定蛋白质含量的方法主要有紫外吸收法、考马斯亮蓝 G-250 染色法、Folin 试剂法（Lowry 法）及微量凯氏定氮法等。每种方法都有其优缺点，可根据实验的具体实际的要求，选不一样的测 定方法。本实验选择了简单而快捷的紫外吸收法和常用的考马斯亮蓝 G-250 染色法。

  3． 染色：将胶从玻璃板中小心取出，用考马斯亮兰染色液染色。 4． 脱色；将胶从染色液中取出,放入脱色液中，脱色至蛋白带清晰。 5． 凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，并利用系统软件分析实

  将以上匀浆转入 50ml 离心管中，在 4℃下，8000×g，离心 15min，将上清和沉淀分开。上 清即为盐溶性溶性蛋白提取液（留样 2（1.5ml）、量体积、测蛋白含量、SDS 化）。

  （二）蛋白含量测定——紫外吸收法 取适量的样品提取液（以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液），根据蛋白质浓度，用

  （三）蛋白提取液的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 1． 聚丙烯酰胺凝胶的配制 （1）分离胶(12%)的配制（10ml）：

  混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平（凝胶完全聚合需 30-60min）。

  （一）鱼肌肉蛋白的提取 1． 称取新鲜的淡水鱼和海水鱼肉各 6g，用刀切碎，分别加入 30 ml 冰冷的 Bufffer I （20mM Tris-Cl, pH8.0），在捣碎机中捣碎成匀浆。 2． 将以上匀浆转入 50ml 离心管中，在 4℃下，10000×g，离心 15min，将上清和沉 淀分开。 3． 上清用四层纱布进行过滤除去脂肪，滤液即水溶性蛋白提取液（留样 1（1.5ml）、 量体积、测蛋白含量、SDS 化） 4． 在以上沉淀中，加入 30 ml 冰冷的蒸馏水，重悬沉淀，在 4℃下，10000×g，离心 15min， 取沉淀。 5． 重复操作 4 二次。 6． 在以上沉淀中，加入 30 ml 冰冷的 Buffer II（Buffer I 含有 0.5M NaCl），重悬沉淀， 再次用组织捣碎机进行捣碎。

  1． 上样：分别取 10μl 处理后的样品加入样品池中，并加入 6μl 蛋白标准品作对照。

  2． 电泳：在电泳槽中加入 1电泳缓冲液，连接电源，注意正负极接向。电泳时，刚 开始电压控制在 90V，当样品到达分离胶后，可将电压调至 180V，电泳至溴酚兰 行至电泳槽下端停止。

  蛋白质在组织或细胞中一般都以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千 种不同的蛋白质，因此，蛋白质的提取、分离和鉴定工作是生物工程中一项十分艰巨的任务。 要想分离提纯某一特定的蛋白，首先必须把蛋白质从组织活细胞中以溶解的状态释放开来。 为此，动物组织或动物细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎，细菌和植物细胞可用超声破、高 压挤压或砂研磨等办法来进行破碎。

  肌肉组织中含有多种蛋白质，具有不一样的电荷、形状和分子量。强阴离子表面活性剂 SDS 与还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的 SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的 负电荷和规则的椭圆形状。在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上，不同蛋白质的 迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮蓝快速染色，可及时观察电泳分离效果。根据电泳结 果，可比较不一样的种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。

  2．样品处理：将样品（以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液）加入等量的 2×SDS 上样缓冲